1.研究背景

        越来越多的研究表明，ROS扮演着抗肿瘤的角色，内源性和外源性的抗氧化剂可以促进肿瘤的进展。Nrf2（NF-E2-related factor 2）是细胞氧化应激反应中的关键因子，受Keap1的调控，通过与抗氧化反应元件ARE（antioxidant response element）相互作用，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达。转录因子BACH1（the transcription factor BTB and CNC homology1，BTB和CNC同源物1）与Nrf2同属b-ZIP家族蛋白，可与Nrf2竞争性结合ARE，从而抑制抗氧化基因的表达，如HMOX-1（编码解毒酶血红素加氧酶1，HO-1，可降解游离血红素），NQO1, （NAD(P)脱氢酶，quinone 1）。细胞在氧化应激条件下，血红素结合蛋白氧化释放游离血红素，游离血红素可使BACH1泛素化降解，从而使抗氧化相关基因表达。

        肺癌是一种死亡率很高的癌症，且大多数患者死于癌症转移。因此，了解控制肺癌转移的基本机制对于临床治疗至关重要。然而，尽管三分之一的肺癌患者中有NRF2或KEAP1突变，但内源性和外源性抗氧化剂在肺癌转移中的作用尚未被探索。

2.研究结果

       作者首先构建肺癌小鼠模型Kras2LSL/+ and Kras2LSL/+Trp53fl/fl mice (简称K和KP)，用低浓度的Cre-adenovirus诱导原发性肺癌，并且在小鼠的饮食当中加入抗氧化剂NAC（n-乙酰半胱氨酸）或VitE（维生素E），喂养一周。发现抗氧化剂喂养的小鼠发生淋巴结转移的概率比control高6-7倍，且诱导远端器官转移。

       进一步，作者用 control 和 NAC-treated K小鼠建立原代肺癌细胞系（mTC 和mTN），发现不管是在体内还是体外，mTN细胞的侵袭和迁移能力显著高于mTC细胞，另外在补充数据中，两株细胞的增殖速率相似。

       抗氧化剂为什么能促进肺癌转移呢？作者通过RNA-seq分析mTC和mTN细胞转录组变化，鉴定出1025个差异基因。进一步分析发现其中267个基因有NRF2-binding motif, 310个基因有BACH1-binding motif。qPCR检测BACH1 和 NRF2 靶向基因，发现在mTN细胞中BACH1的表达轻微上升，其已知的下游基因Nqo1表达下降，新鉴定的下游基因Pkp3、Mmp1a（细胞侵袭相关）表达上升。随后，发现在mTN细胞中，BACH1的蛋白水平显著上调（说明蛋白稳定性增加）；相反，氧化剂可降低BACH1的蛋白水平。

        背景知识已经介绍，free heme（游离血红素）可通过泛素化降解BACH1，作者发现，NAC处理后free heme水平下降，H2O2处理后表达上升。同时，在加入外源血红素后（Hemin，血红素衍生物），BACH1蛋白水平下降。并且，使用蛋白酶体相关抑制剂可以消除Hemin诱导的BACH1降解。

        那BACH1在mTN细胞中起着什么作用呢？调控转移？在KO BACH1之后，mTN细胞的高侵袭能力和肺转移能力被逆转；为进一步验证这一结果，作者使用 CRISPR-SAM (synergistic activation mediator)来提高mTC细胞中内源性BACH1的表达，BACH1的表达增加后，mTC细胞的侵袭、迁移和肺转移能力显著增强。说明BACH1是抗氧化剂诱导的肺癌转移所必须，且在抗氧化剂缺失时，也可诱导肺癌转移。

         BACH1下游的哪些靶基因促进了肿瘤转移呢？作者通过BACH1 Chip-seq和RNA-seq联合分析，发现在mTN细胞中，代谢过程显著改变，糖酵解关键酶HK2（己糖激酶）和GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）表达显著上调，且进一步证明了BACH1可与HK2和GAPDH启动子结合，调控其转录。

       随后，作者进一步分析RNA-seq数据发现，在mTN细胞中，糖酵解途径其它相关酶的转录水平也显著上调，如PFKFB3（编码磷酸果糖激酶）、SLC16A1（编码乳酸转运载体，MCT1）；同时检测糖酵解相关指标发现，在mTN细胞中，糖酵解速率加快，耗氧率下降，葡萄糖摄取和乳酸分泌能力增强；并使用过表达和敲除在mTC和mTN细胞中做了进一步验证。

        接着，作者进一步探究细胞侵袭和糖酵解表型改表之间是否有联系。作者发现，在mTC细胞中过表达HK2后，细胞的糖酵解速率加快，迁移和肺转移能力增强；于此相反，在mTN细胞中过表达G6PC3（葡萄糖6磷酸酶，糖异生途径相关酶）后，细胞的糖酵解速率减慢，迁移和肺转移能力下降。同时，发现在mTN细胞中，糖酵解来源ATP和总的ATP产生速率都要显著高于mTC细胞，且总的ATP水平也显著增加。说明抗氧化剂可以使细胞糖酵解速率加快，促进细胞迁移和侵袭。

        那么抑制糖酵解相关途径酶对细胞迁移有什么影响呢？作者使用抑制剂抑制糖酵解途径相关酶活性，发现2-DG，LND（HK2抑制剂）、DCA（丙酮酸脱氢酶抑制剂）、3-BP（GAPDH抑制剂）、AZD3965（MCT1抑制剂）都可以逆转抗氧化剂所诱导的迁移。

       总结：肿瘤若想快速进展必须克服氧化应激障碍。虽然已有研究发现，膳食中添加抗氧化剂或NRF2激活内源性抗氧化剂可以降低氧化应激，可以促进早期肺癌的进展，但其在肿瘤转移中的作用尚不明确。该研究证明，长期补充抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸和维生素E可促进kras驱动的肺癌转移。抗氧化剂通过降低游离血红素水平来稳定转录因子BACH1，从而刺激肺癌转移；进一步发现，BACH1通过激活HK2和GAPDH的转录，增加葡萄糖摄取、糖酵解和乳酸分泌，从而刺激小鼠和人肺癌细胞糖酵解依赖性转移；靶向抑制BACH1可使得糖酵解正常，预防抗氧化剂诱导的转移；增加内源性BACH1表达促进糖酵解，促进肺癌转移。