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案例与资料

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基于靶向PRL磷酸酶三聚体的新型抗癌药物发现
日期: 2019-09-26 18:58 浏览: 187

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IF8.4

研究思路:靶点结构分析,数据库虚拟筛选,激酶活性实验,细胞实验、化合物结构优化、体外实验验证,体内实验,分子水平作用机制,药物作用模式分析,作用机制实验。


背景

再生肝磷酸酶(PRL)癌蛋白是在多种肿瘤组织中过度表达的磷酸酶。PRL水平升高与肿瘤的转移和不良的临床结果有关。理论上,PRL磷酸酶可以提供有效的治疗靶点,但由于缺乏特异性靶向它的化合物,PRL磷酸酶在肿瘤治疗上仍然没有得到足够的利用。


目的

PRL磷酸酶是通过三聚体来发挥利用,利用这种独特的性质,借助虚拟筛选和药物化学的方法,寻找能够破坏这种三聚体结构的化合物,从而抑制PRL磷酸酶的活性。通过体外和体内实验,验证化合物的抗肿瘤效果。


方法

虚拟筛选:从ZINC database中,筛选能与PRL1单体间界面结合的化合物。分两步对接,刚性对接(DOCK6.2),柔性对接(图1AB)。

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1 PRL1三聚体结构(A)及虚拟筛选流程(B

激酶活性实验:体内、体外。

细胞实验:划痕实验、细胞迁移实验。

化合物结构优化:细胞迁移实验验证。

体外实验验证:构建表达 PRL磷酸酶的细胞和表达三聚体缺陷PRL磷酸酶的细胞。细胞迁移实验验证。

体内实验验证:小鼠实验,表达PRL磷酸酶的小鼠和PRL磷酸酶缺失小鼠的胚胎成纤维细胞。

分子水平作用机制:PRL 1通过激活ERK 1/2AKT途径促进细胞增殖和迁移,探究化合物对ERK 1/2AKT途径的影响。

药物作用模式分析:验证化合物作用于PRL的三聚体界面。

作用机制实验:黑色素瘤TCGA表达数据验证PRL 1的促癌作用,体外和体内实验验证化合物的抑癌机制。


研究成果

经两步虚拟筛选后,得到56 hits,体外和体内激酶实验,筛选到3个化合物(图2C)能够显著降低细胞内PRL1三聚体的形成,其中Cmpd-43最显著(图2D)。Cmpd-43对细胞的侵袭和迁移也有一定的抑制作用(EF

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2 3 hitsC)、体内激酶试验(D)细胞实验(EF


Cmpd-43结构进行优化,得到7个类似物(图3A),细胞的迁移实验表明,类似物 -3显示出与CMPD-43相似的效果,而类似物24-7似乎比CMPD-43略小。但是类似物-1对细胞增殖或迁移没有影响,这表明在类似物-1中缺失的亚氨基甲基芳族部分对PRL1三聚体抑制活性是关键的(图3B)。

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3 Cmpd-43及其类似物对细胞增殖或迁移的影响


表达 PRL磷酸酶的细胞促进了细胞的增殖和迁移,而表达三聚体缺陷PRL磷酸酶的细胞增殖和迁移能力和对照细胞相似,说明PRL磷酸酶的三聚体结构在促进细胞增殖和迁移中扮演重要的角色(4 AB)。用Cmpd-43和类似物-1处理表达 PRL磷酸酶的细胞和表达三聚体缺陷PRL磷酸酶的细胞。Cmpd-43能抑制表达 PRL磷酸酶的细胞,其余的处理组均没有抑制效果(图4 C)。小鼠实验也证明,Cmpd-43能抑制表达 PRL磷酸酶的细胞,而对PRL磷酸酶缺失的细胞无影响(图4 D)。WB实验验证,CMP D-43(5 mmol/l)能特异性抑制Prl 1介导的HEK 293细胞ERK 1/2AKT通路的活化。

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4 Cmpd-43及类似物-1对表达PRL磷酸酶/PRL磷酸酶缺陷细胞的影响


为了验证Cmpd-43是作用于PCL的三聚体界面,从而发挥抑制作用,我们将类似物-3Cmpd-43分别与PRL磷酸酶共结晶,得到了类似物-3结合的PRL1的共晶体,通过结合模式的分析,发现类似物-3确实是与PCLBC界面结合,并且与周围的氨基酸残基作用形成了稳定的构象(图5 ABC)。类似物-3 Tyr14 and Phe132具有较强疏水性接触,而对二聚体界面结合表面的分析表明,这两种残基对三聚体形成的贡献十分有限,因此推测,这两个残基突变会影响类似物-3PCL的结合,但是不会影响PCL的三聚体结构。我们对Tyr14 and Phe132进行了Ala替换。 结果发现,用Ala取代bar 14ph 132PCL三聚和PCL介导的细胞迁移没有影响(图5 DE),并且突变体对Cmpd-43呈现出抗性。这些结果表明类似物-3Cmpd-43是结合在PRL三聚体界面并防止PRL三聚反应。

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5 类似物-3Cmpd-43结合到PRL磷酸酶三聚体界面并阻止PRL三聚结构形成


黑色素瘤TCGA表达数据验证PRL 1的促癌作用(图6 ABCCmpd-43能抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移(图6 DE)。Cmpd-43也能降低HGF诱导的Erk1/2Akt磷酸化(图6FG)。除了PRL 1PRL 2PRL 3也能形成三聚体结构,通过敲除起主要作用的PRL 1PRL 2,发现细胞的ERK1/2 and Akt通路受到抑制(HI),说明Cmpd-43能够同时抑制PRL 1PRL 2PRL 3的活性。

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6 Cmpd-43对黑色素瘤细胞系MeWo.具有抑制作用


黑色素瘤小鼠模型实验,再次验证Cmpd-43通过抑制ERK1/2 and Akt通路,起到抑癌作用(图7)。


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7Cmpd-43在体内抑制黑色素瘤移植瘤的生长